Quantificação de ácidos nucleicos emEspectrofotômetros
A quantificação de ácidos nucleicos é a função mais frequentemente usada de umaEspectrofotómetro.Oligonucleotídeos, single-stranded, double-stranded DNA e RNA podem ser quantificada em buffers. O pico de absorção do pico mais alto de absorção de ácido nucleico é 260 nm. Cada ácido nucleico tem uma diferente composição molecular e, portanto, tem fatores de conversão diferentes. Para quantificar os diferentes tipos de ácidos nucleicos, selecione os coeficientes correspondentes antecipadamente. Por exemplo, a absorvância da 1OD equivale a 50 μg/ml dsDNA, ssDNA 37 de μg/ml, 40 μg/ml RNA e 30 μg/ml Olig, respectivamente. O valor de absorvância depois que o teste é convertido pelo coeficiente acima para obter a concentração de amostra correspondente. Antes do teste, selecionar o procedimento correto, digite os volumes da solução estoque e diluente e testar o espaço em branco e soluções da amostra. No entanto, a experiência não foi fácil. Leituras instáveis podem ser a maior dor de cabeça para experimentadores. Quanto maior a sensibilidade do instrumento, quanto maior for a absorbância exposta de drift.
Na verdade, o princípio de design e princípio de funcionamento doEspectrofotómetropermitir que o valor de absorvância mudar em um determinado intervalo, ou seja, o instrumento tem um certo grau de precisão e exatidão. Como Eppendorf Biophotometer precisão ≤ 1,0% (1A). Os resultados destes testes múltiplos variam entre a média de 1,0% e estão todos normais. Além disso, as propriedades físico-químicas do ácido nucleico, o pH do buffer para a dissolução do ácido nucleico, a concentração de íons, etc. deve também ter em conta: durante o teste, uma muito alta concentração de íons também fará com que a leitura à deriva como TE , que muito irá estabilizar a leitura. A concentração diluída da amostra também é um fator não negligenciável: devido a inevitável presença de pequenas partículas na amostra, especialmente de ácidos nucleicos de amostras. A presença destas partículas pequenas interfere com o efeito de teste. Para minimizar a influência das partículas sobre os resultados do teste, é necessária que a absorção do ácido nucleico seja menos 0.1 A e a absorbância é preferencialmente 0,1-1,5 A. Neste intervalo, deve haver sem bolhas na mistura, e não há nenhuma suspensão o espaço em branco. Caso contrário, as leituras derrapar violentamente; a mesma chávena colorimétrica deve ser usada para testar o espaço em branco e a amostra; caso contrário, a diferença de concentração é muito grande; o coeficiente de conversão e a unidade de concentração de amostra são os mesmos; A cubeta do desgastado pela janela; o volume da amostra deve chegar a mais do que o volume mínimo necessário do copo da cor, etc.
Além da concentração de ácido nucleico, oEspectrofotómetromostra vários rácios muito importantes simultaneamente para indicar a pureza da amostra, tais como a relação A260/A280, com a finalidade de avaliar a pureza da amostra, uma vez que o pico de absorção da proteína é de 280 nm. Amostras de puras têm uma relação maior que 1,8 (DNA) ou 2.0 (RNA). Se a relação for menos de 1.8 ou 2.0, indica a presença de proteínas ou substâncias fenólicas. A230 indica que existem alguns contaminantes na amostra, tais como hidratos de carbono, peptídeos, fenóis, etc. A proporção de ácido nucleico puro A260/A230 for maior que 2.0. A320 detecta a turvação da solução e outros fatores de interferência. Uma amostra pura, A320 é geralmente 0.
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