Introdução ao princípio e aplicação de componentes gerais do espectrofotômetro

O espectrofotômetro é amplamente utilizado em pesquisas biológicas, químicas, clínicas e ambientais.
A espectrofotometria mede quanta luz um produto químico pode absorver passando um feixe de luz através de uma amostra em um espectrofotômetro.
Medindo a intensidade da luz detectada, o método pode ser usado para determinar a concentração de soluto na amostra.
O conceito de espectrofotometria
O feixe enviado para a amostra consiste em um feixe de fótons.
Quando os fótons encontram as moléculas da amostra, elas podem absorver algumas delas, reduzir o número de fótons no feixe e reduzir a intensidade do sinal de detecção.
A transmitância faz parte da luz que passa através da amostra. É definida como a intensidade da luz que passa através da amostra na intensidade da luz incidente.
A absorvância é oposta à transmitância, correspondendo à quantidade medida pelo espectrofotômetro.
De acordo com a absorvância, a concentração da amostra da solução pode ser determinada a partir da lei de Bill Lambert, que mostra que existe uma relação linear entre a absorbância e a concentração da amostra. De acordo com a lei de Lambert da cerveja, a absorvância é o produto do coeficiente de absorção, que é uma medida da quantidade de luz absorvida pelo soluto em um determinado comprimento de onda e a distância pela qual a luz passa. Amostra ou distância de viagem e concentração do soluto. Em geral, o objetivo de medir a absorvância é medir a concentração da amostra.
Componentes do espectrofotômetro
Cada espectrofotômetro consiste em uma fonte de luz, um colimador (lente ou um dispositivo de focagem para transmitir feixes fortes e retos), um monocromador para separar feixes de diferentes comprimentos de onda e um seletor de comprimento para selecionar a onda ou ranhura do comprimento de onda desejado. O comprimento de onda da luz usada no espectrofotômetro apresentado neste vídeo está na faixa de luz ultravioleta e visível. O espectrofotômetro também inclui um porta-amostras, um fotodetector e uma tela exibindo os resultados do detector.
O espectrofotômetro mais recente é acoplado diretamente a um computador, onde os parâmetros experimentais podem ser controlados e os resultados exibidos.
Princípio de funcionamento do espectrofotômetro
Ao executar a espectrofotometria, é importante tomar as devidas precauções, como usar luvas, dependendo do tipo de solução biológica ou química usada.
Ligue o dispositivo e permita que a lâmpada e os componentes eletrônicos aqueçam antes de medir o espectro UV-Vis da amostra.
Prepare uma amostra em branco da mesma solução com o mesmo pH e força iônica semelhante, mas sem os componentes a serem analisados; como a cubeta e o solvente podem dispersar a luz, é necessário analisar a amostra.
O suporte tradicional para amostras de espectrofotômetro foi projetado para armazenar tigelas de plástico e quartzo. Pipete a solução original para uma tigela.
Depois de limpar as impressões digitais e espirrá-las na parte externa da tigela, insira a cubeta corretamente no porta-amostras e feche a porta da tampa.
Nunca se esqueça de fechar a porta porque a radiação UV de um espectrofotômetro aberto pode danificar seus olhos e pele.
Programe o comprimento de onda desejado ou a faixa de comprimento de onda que será transmitida à amostra. Isso depende do melhor comprimento de onda que o componente que está sendo analisado pode absorver. A máquina é zerada medindo a amostra em branco, que subtrai a absorvância inferior devido ao buffer da amostra.
Dependendo do tipo de experimento de espectrofotometria que você está realizando, pode ser necessário gerar uma curva padrão antes da medição da amostra, a partir da qual a concentração do composto analisado na amostra pode ser determinada.
Deixe a amostra atingir a temperatura adequada e misture delicadamente para evitar a introdução de bolhas. A amostra pode ser adicionada diretamente à tigela dentro da máquina e uma leitura pode ser feita.
Após a amostra ter sido medida quanto à absorbância, o experimento é calculado adequadamente; por exemplo, para determinar o nível de concentração ou atividade enzimática.
Aplicação do espectrofotômetro
Um dos usos comuns do espectrofotômetro é medir a densidade celular. A medição da densidade celular pode ser usada para produzir a curva de crescimento logarítmico de bactérias, a partir da qual o tempo ideal para a integração da proteína recombinante pode ser determinado.
O espectrofotômetro também pode ser usado para medir a taxa de reação química. Nesta modalidade, a absorvância é usada para monitorar a reação enzimática, que desaparece com o tempo através de uma reação intermediária de 452 nm. A taxa deste passo enzimático pode ser calculada combinando os dados com a equação apropriada.
A introdução do micro espectrofotômetro elimina a necessidade do suporte de amostras. Esses espectrofotômetros usam tensão superficial para manter a amostra.
O microespectrofotômetro é a melhor opção para medir a massa e a concentração de amostras pequenas e caras, como biomoléculas, incluindo proteínas e ácidos nucléicos.
A absorvância de proteínas a 280 nm depende do conteúdo de cadeias laterais aromáticas encontradas no triptofano, tirosina e fenilalanina, bem como na ligação dissulfeto entre as duas cisteínas.
A concentração de proteína pode ser determinada pela sua absorvância a 280 nm e pelo seu coeficiente de absorção, que é baseado na composição dos aminoácidos.
O DNA e o RNA têm a absorvância máxima em 260 nm, a partir da qual suas concentrações podem ser determinadas. A pureza dos ácidos nucleicos também pode ser avaliada a partir da razão das leituras de absorvância para comprimentos de onda específicos.