Espectrofotômetros tornaram-se instrumentos de rotina em laboratórios modernos de biologia molecular. Freqüentemente usado para ácido nucléico, quantificação de proteína e quantificação de concentrações de crescimento bacteriano.
Princípio simples do espectrofotômetro
O espectrofotômetro usa uma fonte de luz que pode gerar múltiplos comprimentos de onda e passa por uma série de dispositivos espectroscópicos para gerar uma fonte de luz com um comprimento de onda específico. Depois que a fonte de luz passa pela amostra a ser testada, parte da fonte de luz é absorvida e a absorbância da amostra é calculada, convertendo-se assim em uma concentração de amostra. . A absorbância da amostra é proporcional à concentração da amostra.
Quantificação de ácidos nucléicos
A quantificação de ácidos nucléicos é a função mais utilizada do espectrofotômetro. Os oligonucleótidos, ADN de cadeia simples, fita dupla e ARN podem ser quantificados num tampão. O pico de absorção do pico de absorção mais elevado do ácido nucleico é de 260 nm. A composição molecular de cada ácido nucleico é diferente, portanto os fatores de conversão são diferentes. Para quantificar os diferentes tipos de ácidos nucleicos, selecione os coeficientes correspondentes antecipadamente. Por exemplo, a absorbância de 1 OD corresponde a 50 µg / ml de dsDNA, 37 µg / ml de ssDNA, 40 µg / ml de RNA e 30 µg / ml de Olig. A absorvância após o teste é convertida pelos coeficientes acima para obter a concentração da amostra correspondente. Antes do teste, selecione o procedimento correto, insira o volume da solução padrão e do diluente e, em seguida, teste a solução de amostra e o branco. No entanto, o experimento nem sempre foi suave. Leituras instáveis podem ser a maior dor de cabeça para o experimentador. Instrumentos com maior sensibilidade mostram maior desvio na absorbância.
De fato, o princípio de projeto e o princípio de funcionamento do espectrofotômetro permitem que a absorbância varie dentro de uma determinada faixa, ou seja, o instrumento tem certa exatidão e precisão. Por exemplo, a precisão do Biofotômetro Eppendorf é ≤1,0% (1A). Os resultados desses testes múltiplos variam entre cerca de 1,0% da média e são normais. Além disso, também é necessário considerar as propriedades físico-químicas do próprio ácido nucléico e o pH do tampão em que o ácido nucléico é dissolvido, a concentração de íons, etc .: Quando a concentração de íons é muito alta durante o teste, o os turnos de leitura, por isso, recomenda-se usar um determinado valor de pH e uma baixa concentração de íons. Buffers, como o TE, estabilizam muito as leituras. A concentração de diluição da amostra também é um fator que não pode ser ignorado: devido à presença inevitável de algumas partículas finas, especialmente amostras de ácido nucléico, na amostra. A presença dessas pequenas partículas interfere nos resultados do teste. De modo a minimizar o efeito das partículas nos resultados do teste, a absorvância do ácido nucleico é necessária para ser pelo menos superior a 0,1 A e a absorvância está preferencialmente entre 0,1 e 1,5 A. Dentro desta gama, a interferência do as partículas são relativamente pequenas e o resultado é estável.
Isso significa que a concentração da amostra não deve ser muito baixa ou muito alta (além da faixa de teste do fotômetro). Finalmente, os fatores operacionais, como a mistura, devem ser suficientes, caso contrário, o valor da absorbância é muito baixo, mesmo valores negativos; a mistura não pode existir bolhas, o líquido em branco não tem matéria suspensa, caso contrário a leitura deriva drasticamente; a mesma cubeta deve ser usada para testar o branco ea amostra. Caso contrário, a diferença na concentração é muito grande; o fator de conversão e a unidade de concentração da amostra são selecionados de forma consistente; a cuvete com o desgaste da janela não pode ser usada; o volume da amostra deve atingir o volume mínimo requerido pela cuvete.
Além da concentração de ácido nucléico, o espectrofotômetro também mostra várias razões muito importantes indicando a pureza da amostra, como a relação de A 260 / A 280, usada para avaliar a pureza da amostra porque o pico de absorção da proteína é 280 nm. Uma amostra pura com uma razão maior que 1,8 (DNA) ou 2,0 (RNA). Se a razão for menor que 1,8 ou 2,0, indica a presença de proteínas ou substâncias fenólicas. Um 230 indica que alguns contaminantes estão presentes na amostra, tais como hidratos de carbono, péptidos, fenóis, etc, e a razão do ácido nucleico mais puro A 260 / A 230 é superior a 2,0. Um 320 detecta a turbidez da solução e outros fatores de interferência. Para amostras puras, A 320 é geralmente 0.
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