Quantificação de proteínas colorimétricas espectrofotométricas
Proteínas são geralmente uma mistura de proteínas. Ensaios colorimétricos são baseados em constituintes de proteínas: Aminoácidos (por exemplo, tirosina, serina) reagem com um grupo cromogênico adicional ou corante para produzir um material colorido. A concentração do material colorido está diretamente relacionada ao número de aminoácidos que a proteína reage, refletindo assim a concentração de proteína.
Método colorimétrico
Existem vários métodos, como BCA, Bradford e Lowry.
O método de Lowry: Baseado na primeira reação de Biuret e melhorado. A proteína reage com Cu2 para produzir uma reação azul. No entanto, o método de Lowry é mais sensível que o Biuret. A desvantagem é a necessidade de adicionar sequencialmente vários reagentes diferentes; a reação leva muito tempo; é suscetível a substâncias não proteicas; proteínas contendo EDTA, Triton x-100 e sulfato de amônia não são adequadas para este método.
Ensaio do ácido bicinconiinina: Este é um ensaio de proteínas mais recente e mais sensível. A proteína a ser analisada reage com Cu2 em uma solução alcalina para produzir Cu, que forma um quelato com BCA para formar um composto púrpura com um pico de absorção a 562 nm. A relação linear entre a concentração deste composto e a proteína é forte, e o composto formado após a reação é muito estável. Em relação ao método de Lowry, a operação é simples e a sensibilidade é alta. No entanto, semelhante ao método de Lowry, é suscetível a interferências com proteínas e detergentes.
O método de Bradford: O princípio deste método é que a proteína reage com Coomassie Brilliant Blue para produzir um composto colorido que absorve a 595 nm. Sua maior característica é sua sensibilidade, que é 2 vezes maior que a de Lowry e BCA. É mais simples e rápido. Requer apenas um tipo de reagente de reação. O composto pode ser estável durante 1 hora para facilitar o resultado; Interferindo com Lowry, o BCA reage com agentes redutores (por exemplo, DTT, mercaptoetanol) compatíveis. No entanto, ainda é sensível a detergentes. A principal desvantagem é que diferentes padrões podem levar a grandes diferenças nos resultados da mesma amostra e nenhum resultado comparável.
Alguns pesquisadores que são expostos a medidas colorimétricas pela primeira vez podem ser confundidos pelos resultados dos vários testes colorimétricos. Que tipo de métodos você acredita estar confuso? Devido ao fato de que os grupos reagiram de maneiras diferentes e os grupos cromogênicos não são os mesmos, vários métodos são usados simultaneamente para tornar as concentrações da amostra da mesma amostra inconsistentes. Por exemplo, Keller et al. testaram a proteína no leite humano e descobriram que as concentrações medidas por Lowry e BCA eram significativamente maiores do que as de Bradford. A diferença foi significativa. Mesmo que a mesma amostra seja determinada, a amostra padrão selecionada pelo mesmo método colorimétrico é inconsistente e a concentração após o teste também é inconsistente. Por exemplo, use Lowry para testar a proteína no homogenato de células, usando BSA como padrão, com uma concentração de 1,34 mg / ml, e uma globulina como um padrão com uma concentração de 2,64 mg / ml. Portanto, antes de selecionar um método colorimétrico, é preferível referir-se à composição química da amostra a ser testada e encontrar uma proteína padrão quimicamente similar como padrão. Além disso, o método colorimétrico para quantificar proteínas freqüentemente causa problemas, pois o valor de absorbância da amostra é muito baixo, resultando em uma grande diferença entre a concentração da amostra medida e a concentração real. A questão-chave é que a cor da parte importante do espectrofotômetro 1011, a cubeta, tem uma certa meia-vida, de modo que cada método colorimétrico lista o tempo do teste de reação. Todas as amostras (incluindo amostras padrão) devem ser testadas dentro deste tempo. Se o tempo for muito longo, o valor de absorbância obtido torna-se menor e o valor de concentração convertido diminui. Além disso, a temperatura da reação, o valor de pH da solução, etc., são fatores importantes que afetam o experimento. Além disso, é muito importante usar a colorimetria plástica. Evite usar cuvetes feitas de quartzo ou vidro porque a cor após a reação fará com que o quartzo ou o vidro sejam coloridos, resultando em uma absorção imprecisa da amostra.
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